为了分离到足够量、有活力的花原茉莉花原生质体,本试验采用酶解法,针对不同组织器官、不同处理方式、生质时表酶解液组合、体瞬酶解时间等因素进行了摸索和优化。达体
借鉴拟南芥和番茄叶片原生质体制备方法,初步尝试从茉莉花叶片分离原生质体,然而得到的原生质体多为细胞碎片,且形状异常,FDA染色大部分无荧光,显示存活率极低(图1-A,B)。然而,茉莉以茉莉花花瓣为试材时,在相同的酶解液中可收集到形态良好,FDA处理发荧光,有活力的原生质体(图1-C,D),因此在接下来的研究中须专注于优化茉莉花花瓣的原生质体分离体系。
尝试了用切丝法、花原胶撕法和磨砂法在酶解前分别对花瓣组织进行处理(图2-A,生质时表B,C),以使花瓣细胞能充分接触酶解液。在4m1相同酶解液中孵育6h后,体瞬收集观察原生质体产量,在3次独立重复试验中均显示切丝法获得的原生质体数量最多,胶撕法次之,磨砂法得到的原生质体产量最低(图3)。考虑到操作的达体简易性,切丝法处理茉莉花花瓣对原生质体分离最有效。
在含4G·1-1离析酶和2G·1-1果胶酶的酶解液中梯度增加纤维素酶的质量浓度从5至30G·1-1,检测结果显示(图4-A),在一定浓度范围内,原生质体产量随纤维素酶质量浓度提高而增加,当浓度为15G·1-1时,原生质体产量达到峰值,为1.34×106个·G-1,死亡率为29.1％；随着纤维素酶质量浓度继续升高,原生质体产量和活力都开始下降,细胞破碎程度严重。因此,茉莉分离茉莉花花瓣原生质体较适宜的纤维素酶质量浓度为15G·1-1。在含4G·1-1离析酶和15G·1-1纤维素酶的花原酶解液梯度增加果胶酶的质量浓度从2至10G·1-1,花瓣原生质体产量检测结果显示(图4-B),随果胶酶浓度升高,原生质体产量同步增加,当果胶酶质量浓度为8G·1-1时,原生质体产量最高,为1.48×106个·G-1,死亡率较低,为31.0％,较适宜花瓣原生质体的分离.试验表明,酶解液中最佳的纤维素酶和果胶酶质量浓度分别为15和8G·1-1。
为进一步优化茉莉花花瓣原生质体的生质时表分离效率,选取4个酶解时间段3、4、5、6h,采用上述优化后的酶解液组合,检测释放出来的原生质体总量及死亡率。如图4-C所示,随着酶解时间延长,原生质体产量逐步增多,在酶解5h时,原生质体产量最高,达到2.96×106个·G-1,死亡率为23.5％,相对较低.因此最适合酶解时间为5h。
本研究进一步采用PEG介导法,探讨了原生质体终浓度、外源dnA含量、不同PEG处理等对茉莉花花瓣原生质体瞬时转化效率的影响。
将收集的花瓣原生质体稀释成不同终浓度的细胞液,经相同的转化方法和孵育时间,荧光显微镜下统计原生质体转化效率,结果如图5-A所示,相同转化体系中,外源dnA含量为100μG·m1-1原生质体时,最适合转化的茉莉花花瓣原生质体浓度为4×105个·m1-1,转化效率约78％。
向原生质体浓度为4×105个·m1-1的转化体系中加入不同量的P35s-GFP质粒,经相同的PEG处理和孵育时间,结果如图5-B所示,当转化体系中dnA含量为75μG·m1-1原生质体时,转化效率最佳,约为79％。
本研究分析了不同终浓度的PEG4000对茉莉花花瓣原生质体转化效率的影响(图5-C)。在终浓度为200G·1-1的PEG处理下花瓣原生质体的转化效率显著高于其他浓度,其次是150和250G·1-1的PEG终浓度,50G·1-1PEG处理下原生质体转化效率最低。
为进一步优化转化体系,本试验还比较了PEG诱导时间对原生质体转化效率的影响(图5-D)。PEG处理时间在10min以内,原生质体转化效率均达到70％以上,当处理时间超过15min,转化效率显著降低。
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